SnapGene操作指南 | 引物设计Ⅰ

 

什么是引物(Primers)?

 

引物是聚合酶链反应（PCR）技术中使用的短单链DNA序列。在PCR方法中，使用一对引物与样品DNA杂交并确定将被扩增的DNA区域。引物也称为寡核苷酸(Oligonucleotides)。（参考上图）

 

 

 

引物具备哪些特性？

引物的主要特性是它们必须与模板分子上的序列相对应(必须与模板链互补)。

 

引物有长短之分。短引物主要用于扩增小而简单的DNA片段，而长引物用于扩增真核基因组DNA样本。引物不宜过长(> 30-mer primers)或过短。过短的引物会产生不准确的非特异性DNA扩增产物，过长的引物会导致杂交速率降低。平均而言，需要扩增的DNA片段大小应该在1-10 kB以内。

 

引物结构要相对简单，不含内部二级结构，避免内部折叠。同时，还需要避免“Primer-Primer”退火(Annealing)，这种退火会产生引物二聚体(primer dimers)并破坏扩增过程。设计时，如果不确定要在引物的某个位置放置什么核苷酸(nucleotide)，可以在该位置包括多个核苷酸，称为混合位点(mixed site)。也可以使用基于核苷酸的分子插入物(肌苷, inosine)来代替常规核苷酸，以实现更广泛的配对能力。

 

<总结>

 

• 18-24个碱基的长度；
• G / C含量在40-60％；
• 起止于1-2 G/C对；
• 熔化温度（Tm）为50-60°C；
• 引物对之间的Tm应在5°C之内；
• 引物对不应该有互补区域。

 

Step 1 粘贴引物序列

 

 

点击Primers→Add Primer…，然后复制粘贴序列。

 

Step 2 选择绑定位点（可选）

 

 

或者，可以从在序列上选择所需的绑定站点开始。点击鼠标并拖动以进行选择，相应引物的熔化温度就会显示出来。在所选位置添加引物，Primers→Add Primer。

 

Step 3 选定底链或顶链（可选）

 

若引物是从选定的结合位点制成的，需要指定是选择Top Strand还是Bottom Strand。

 

Step 4 引物命名

 

 

如有需要，可以为引物命名，方便后续管理。

 

Step 5 输入描述

 

 

如有需要，可以输入详细描述。Description页签是默认打开的。

 

Step 6 修改引物

如需要，可以修改引物以增加一个5’ 扩展或引入突变。SnapGene提供两种方法：

 

 

一种是在文本框中手动编辑引物序列；

 

 

另一种是在变更位置单击引物序列，然后单击Insertions选项卡。使用对话框控件添加所需的密码子、限制位点、或肽编码序列。

 

Step 7 查看结合部位和熔化温度

 

结合位点的数目和计算的熔化温度显示在窗口的底部。点击对话框右下角的蓝色文本，可以看到熔化温度计算方法的总结。

 

Step 8 查看引物

 

 

点击Add Primer to Template可以查看新的引物。

 

Step 9 选择多个引物

 

 

如要批量编辑多个引物，首先选中目标引物。打开Edit Primers对话框，点击Primers→Edit Primers。

 

Step 10 确认改动点

 

 

如上图选择想要修改的引物颜色、磷酸化、和字体，然后点击OK。

Step 11 查看更新的引物

 

 

可以看到更新后的引物，如上面序列视图举例，引物的颜色被更改为红色。

 

 

 

而在上面Map视图中，可以看到更新颜色后的引物有圆点标记。